前言:
谷類(lèi)淀粉的許多特性決定其最終用途，這些取決于直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率。這些特性包括糊化和凝膠化，溶解度，抗性淀粉的形成以及整顆大米的烹飪和構造特性。因此，淀粉中直鏈淀粉含量的測定是淀粉加工的一個(gè)重要的質(zhì)量參數。
最常用的測定谷物淀粉中直鏈淀粉含量的方法是利用電勢，電流測定或直鏈淀粉的碘結合能力比色測定直鏈淀粉-碘色合配合物。然而，這些方法具有不確定性。支鏈淀粉-碘復合物也可以形成，這樣降低了利用非比色法測定的游離碘離子的濃度，并且用比色法測量時(shí)，該復合物可能和直鏈淀粉-碘復合物吸收相同波長(cháng)的光。這種復合物致使直鏈淀粉的測定含量超過(guò)實(shí)際含量，需要進(jìn)行校正。Gibson等詳細列舉了使用這些方法所遇到的許多其他問(wèn)題。
支鏈淀粉結合ConA的特殊復合物為淀粉中直鏈淀粉的測定提供了一種替代方法，而且不存在不確定性問(wèn)題。在指定pH值，溫度和離子強度的條件下，ConA特異性結合分支多糖并形成沉淀，這種結合以多個(gè)非還原性末端基團上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基單位為基礎。因此，ConA可以有效結合淀粉中的支鏈淀粉成分，但是不能結合線(xiàn)性為主的直鏈淀粉成分。
此方法是Yun和Matheson改進(jìn)的ConA方法。分析之前用乙醇預處理去除脂質(zhì)。
原理：
淀粉樣品通過(guò)加熱完全地溶解在二甲基亞砜（DMSO）里。用乙醇沉淀淀粉去除其中的脂質(zhì)，回收沉淀的淀粉。用醋酸/鹽溶液溶解沉淀的樣品，加入ConA，特異性沉淀支鏈淀粉，離心去除沉淀。單位體積上清液中的直鏈淀粉用酶水解為D-葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑進(jìn)行測定。另外一份單位體積醋酸/鹽溶液中的總淀粉同樣用酶水解為D-葡萄糖，然后加入葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶，用比色法測定。
根據ConA沉淀樣品的上清液和與總淀粉樣品中的GOPOD在510 nm處的吸光光度值之比判斷直鏈淀粉在總淀粉中的含量。
該方法適用于所有的純淀粉和谷物粉。
精確性
樣品如為純淀粉，相對標準偏差為<5%。
樣品如為谷物面粉，相對標準偏差為～10%。
試劑盒內容：
瓶子1：凍干的Con A (伴刀豆球蛋白 A concanavalin A) ，200 mg，-20℃下穩定性>5年。
瓶子2：淀粉葡糖苷酶【200U，條件為消化對硝基苯基β-麥芽糖苷(也就是3300U，條件為pH4.5，40℃下消化淀粉)】加上真菌α-淀粉酶(500U ，條件為pH5.0，40℃下消化 Ceralpha 試劑)，2mL，4℃下穩定性>5年。
瓶子3：GOPOD 試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液(1M，pH7.4)，對羥苯甲酸(0.22M)和疊氮化鈉(0.02% W/W)。4℃下穩定性> 3年。
瓶子4：GOPOD試劑酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上過(guò)氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。凍干粉，-20℃下穩定性>5年。
瓶子5：D-葡萄糖標準溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室溫下穩定性>5年。
瓶子6：淀粉參考樣品(含有特定含量的直鏈淀粉)，室溫下穩定性>5年。
試劑制備的準備：
1、用50mlCon A試劑將瓶子1中藥品溶解，分成適當的幾部分存放在聚丙烯管中，盡可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下穩定性>2年。
2、用20ml醋酸鈉緩沖液將瓶子2中的藥品溶解，分成適當的幾部分存放在聚丙烯管中，盡可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下穩定性>2年。
3、用蒸餾水將中的藥品（GOPOD 試劑緩沖液）稀釋至1L?，F配現用。
(注意：如果瓶子3意外存放在-20℃下，一些鹽可能會(huì )結晶。配制時(shí)要確保所有的結晶物質(zhì)都溶解在1L的蒸餾水中）
4、用20ml GOPOD 試劑緩沖液溶解GOPOD試劑酶，并定量的轉移到存放GOPOD 試劑緩沖液的瓶子中，用鋁箔封住瓶子，避光保存。這種試劑黑暗中保存，2-5℃下能保存大約3個(gè)月，-20℃下穩定性大于12個(gè)月。
5、按提供的方法使用D-葡萄糖標準溶液和淀粉參考樣品，室溫下穩定性>5年。
安全考慮：
1、DMSO對皮膚有刺激性，用的時(shí)候要格外小心。它通過(guò)皮膚被吸收，對皮膚和眼睛都有刺激性。穿保護裝、戴手套，避免溶劑濺出。盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行試驗。
2、ConA通過(guò)呼吸、皮膚接觸或攝入體內，對人體是十分有害的。這種傷害不可逆轉，可能會(huì )致畸。在使用ConA結晶體球蛋白和含有ConA的溶劑時(shí)要穿保護裝、戴手套和特制的面具。
3、疊氮化鈉是有毒的化學(xué)試劑，必須要有專(zhuān)門(mén)的處理。它要添加特殊的緩沖液來(lái)充當防腐劑。毒性通過(guò)緩沖可以被消除，但是緩沖液必須在4℃下保存。
緩沖液或溶劑：
1、乙酸鈉緩沖液（10mM,pH 4.5）
加5.9ml1.05g/ml的冰醋酸到900ml的蒸餾水中用4g/100ml的NaOH溶液調pH到4.5（大約30ml）,加0.2g疊氮化鈉，用蒸餾水定容至1L。室溫下穩定性>2年。
2、ConA 濃縮液(600 mM, pH 6.4 乙酸鈉緩沖液)
稱(chēng)取49.2g無(wú)水醋酸鈉，175.5g氯化鈉，0.5gCaCl2.2H2O ，0.7 gMgCl2.6H2O 和0.7 g MnCl2.4H2O ，用900 mL 蒸餾水將其溶解逐滴加入冰醋酸調pH為6.4，再用蒸餾水定容至1L。4℃下保存2周。（注意：配制這種復合緩沖液時(shí)，pH的調節特別重要，如果pH低于6.4，就會(huì )有沉淀物形成，就算pH再調回來(lái)，沉淀物也不會(huì )溶解。結果會(huì )導致緩沖液必須丟棄重新配制。）
3、ConA 溶液（使用濃度）
將30ml ConA 濃縮液用蒸餾水稀釋至100ml?，F配現用。
4、DMSO
分析純試劑。室溫下可保存5年。
預處理：淀粉樣品事先用乙醇進(jìn)行預處理，除去脂質(zhì)。如果樣品沒(méi)有用乙醇進(jìn)行預處理，在某些樣品中測得的直鏈淀粉含量會(huì )低50%。
實(shí)驗步驟：
A、淀粉預處理
1、準確稱(chēng)取淀粉或面粉樣品至10ml的樣品管中。記錄樣品重量精確到0.1mg。
2、加1ml DMSO至試管，在漩渦混合器中慢速混勻，在沸水浴中加熱直至分散（大約1分鐘）確保淀粉沒(méi)有結團結塊。
3、密封試管，高速混勻。沸水浴加熱15min，再高速間歇混勻。
4、室溫放置大約5min，加2ml 95%乙醇，混勻，再加4ml乙醇，蓋上蓋子，顛倒混勻。形成淀粉沉淀物，將試管靜止15min（條件允許過(guò)夜靜止）。
5、2000r,5min離心，棄去上清液，倒置在紙巾上10min,確保乙醇全部揮發(fā)。在接下來(lái)直鏈淀粉和淀粉的測定中使用此沉淀物。
6、加2ml DMSO到淀粉沉淀物中，將試管沸水浴15min(間或混勻)，確保沒(méi)有塊狀。
7、從沸水浴中取出試管，立即加入4ml ConA 溶液，將試管中藥品轉移至25ml容量瓶中。用 ConA 溶液定容。
（整個(gè)過(guò)程必須在2h內完成）
B、支鏈淀粉- ConA 沉淀物和直鏈淀粉的測定
1、量取1mlA試劑到2ml的試管中，加0.54ml的ConA 溶液，蓋上蓋子，反復顛倒，混勻。避免樣品起泡。
2、室溫靜置1h。14000r，10min，室溫下離心。
3、轉移1ml的上清液到15ml的離心管中，，加3ml100mM醋酸鈉緩沖液，pH4.5，混合藥品。輕輕塞住管口，沸水浴5min，使ConA變性。
4、將試管在40℃下水浴，平衡5min，，加1ml淀粉轉葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物，40攝氏度下反應30min，2000r離心5min。
5、準確量取1ml上清液，加4ml GOPOD試劑，40攝氏度下反應20min，使空白試劑和D-葡萄糖標準液同時(shí)反應。
6、在510nm下測定每一個(gè)樣品和D-葡萄糖標準液的吸光光度值。
C、總淀粉的測定
1、將0.5mlA溶液和4ml100mM乙酸鈉溶液混合，pH 4.5
2、加1ml淀粉轉葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物，40攝氏度下反應10min，
3、準確量取1ml上清液，加4ml GOPOD試劑，40攝氏度下反應20min。這個(gè)反應必須讓樣品和標準液按B部分同時(shí)進(jìn)行。
